    3.3. Действие ЭВР на поверхностный потенциал  и энергетику тимоцитов.
         Помимо разности потенциалов между внутренней и наружной сторонами
    мембран живых клеток (потенциала покоя),  которая обусловлена  работой
    активных  ионных насосов и диффузным распределением ионов,  существует
    поверхностный потенциал,  который обусловлен  фиксированными  зарядами
    мембраны.  У  всех живых клеток поверхностный потенциал отрицательный.
    Он зависит от рН среды.  С увеличением рН отрицательный заряд  поверх-
    ности возрастает, с уменьшением рН - заряд уменьшается.
         Дзета-потенциал определяют  как  потенциал  поверхности  мембраны
    вместе с первым слоем противоионов и первым слоем молекул воды,  кото-
    рые остаются связанные поверхностью мембраны  при  движении  клетки  в
    омывающем  растворе.  То  есть  дзета-потенциал  это потенциал границы
    скольжения клетки относительно потенциала объема раствора.
         Стабильность коллоидных растворов и взвесей клеток в значительной
    мере зависит от величины дзета-потенциал частиц. Для того, чтобы прои-
    зошло склеивание (аглютинация) частиц, необходимо их сближение на дос-
    таточное расстояние.  Одноименный поверхностный потенциал клеток  пре-
    пятствует их сближению и аглютинации и седиментации.  Величина сил от-
    талкивания возрастает пропорционально величине  дзета-потенциала  кле-
    ток. Факторы, которые приводят к уменьшению дзета-потенциала, вызывают
    усиление коагуляции коллоидов и аглюцинации взвешенных клеток. Величи-
    на  дзета-потенциала  снижает при увеличении концентрации ионов в дис-
    персионной среде. Коагулирующее действие электролитов зависит и от ва-
    лентности ионов,  знак заряда которого противоположен знаку заряда по-
    верхности частицы.  Например, аглютинацию эритроцитов и бактерий уско-
    ряют соли многовалентных катионов:  алюминия, лантана, тория. Стабиль-
    ность взвешенных клеток зависит не только от величины сил отталкивания
    определяемых дзета-потенциалом, но и от величины сил сцепления - кохе-
    зионных сил,  склеивающих при их достаточном сближении. Эти силы сцеп-
    ления  определяют критическую величину дзета-потенциала клеток необхо-
    димую для их уравновешивания.
         Описанные положения  в  какой-то мере объясняют механизм действия
    иммунных веществ - аглютининов. При выработке иммунитета в крови обра-
    зуются аглютинины способные специфически адсорбирующиеся на поверхнос-
    ти бактерий,  с одной стороны увеличивают силы сцепления,  а с  другой
    уменьшают дзета-потенциал клеток,  что в конечном итоге приводит к аг-
    лютинации бактерий.
         В наших экспериментах дзета-потенциал определяли измеряя скорость
    движения клеток в электрическом поле приложенном с помощью  электроле-
    тических мостиков к камере Горяева под микроскопом.  Средой служил фи-
    зиологический раствор, который активировали в электроактиваторе "Эспе-
    ро-1".  Использовали  как свежеприготовленные католит и анолит,  так и
    католит и анолит в которых требуемые величины рН и  окислительно-восс-
    тановительного  потенциала  (ОВП)  получали добавляя гидроокись натрия
    или соляную кислоту, или добавляя к католиту анолит. Так как дзета-по-
    тенциал менялся в зависимости от времени нахождения клеток в активиро-
    ванных растворах,  измерения проводили через различные промежутки вре-
    мени, пока он не стабилизировался. Тимоциты получали как описано ниже.
         В таблице  3.7 представлены результаты измерения дзета-потенциала
    у тимоцитов.  В неактивированном физиологическом растворе дзета-потен-
    циал тимоцитов быстро устанавливается на значении 16,7 мВ при примерно
    80% движущихся тимоцитах. 20% тимоцитов, возможно, вследствие прилипа-
    ния к стеклу камеры Горяева остаются с самого начала неподвижными. При
    внесении тимоцитов в капельке буфера в растворы католита,  также  при-
    мерно 80% тимоцитов начинают движение в электрическом поле, причем на-
    чальная их скорость быстро уменьшается и устанавливается только  через
    30-40 минут. Так как невозможно было измерить рН и ОВП в объеме камеры
    Горяева о количественной стороне результатов говорить  строго  нельзя,
    то есть,  что такому-то ОВП соответствует такой-то дзета-потенциал. На
    основании результатов представленных в таблице можно сделать лишь  ка-
    чественный  вывод  о том,  что в растворах католита отрицательный дзе-
    та-потенциал тимоцитов возрастает, а в растворах анолита падает. Кроме
    того,  в  растворах  анолита растет процент аглютинирующих тимоцитов в
    зависимости от времени и ОВП, и в конце концов практически все тимоци-
    ты аглютинируют - собираются в группы и прилипают к стеклу.

                                                          Таблица 3.7
          Дзета-потенциал тимоцитов крысы в  различных  электрохими-
                       чески-активированных растворах.

    --------------T---------------------------------------------------
    |             |                  Время инкубации                 |
    |  Среда      +------------T-------------T-----------T-----------+
    |             |   10 мин.  |  20 мин.    |  30 мин.  |  40 мин.  |
    +-------------+------------+-------------+-----------+-----------+
    |Католит      |            |             |           |           |
    |физраствора  |  -39.2мВ   |   -32.3мВ   |  -31.4мВ  |  -31.0мВ  |
    |рН=11,5      |            |             |           |           |
    |ОВП=-800мВ   |            |             |           |           |
    |             |            |             |           |           |
    |Католит      |            |             |           |           |
    |физраствора  |            |             |           |           |
    |рН=10.0      |  -37.3мВ   |   -31.7мВ   |  -30.7мВ  |  -30.3мВ  |
    |ОВП=-600     |            |             |           |           |
    |(доводили    |            |             |           |           |
    | анолитом)   |            |             |           |           |
    |             |            |             |           |           |
    |Католит      |            |             |           |           |
    |физраствора  |  -25.3мВ   |   -20.5мВ   |  -20.2мВ  |  -20.2мВ  |
    |рН=7.0       |            |             |           |           |
    |ОВП=-400     |            |             |           |           |
    |(доводили    |            |             |           |           |
    |  НС1)       |            |             |           |           |
    |             |            |             |           |           |
    |Контроль     |            |             |           |           |
    |физраствор   |   -17.3мВ  |    -16.7мВ  |   -16.7мВ |   -16.7мВ |
    |рН=7.0       |            |             |           |           |
    |ОВП=+200     |            |             |           |           |
    |             |            |             |           |           |
    |Анолит       |            |             |           |           |
    |физраствора  |            |             |           |           |
    |рН=7.0       |   -16.4мВ  |    -10.2мВ  |   -5.7мВ  |   -5.3мВ  |
    |ОВП=-150     |            |             |           |           |
    |(доводили    |            |             |           |           |
    | NаОН)       |            |             |           |           |
    |             |            |             |           |           |
    |Анолит       |            |             |           |           |
    |физраствора  |    -12,4мВ |    -7,6мВ   |    -3,1мВ |    -2,9мВ |
    |рН=4,0       |            |             |           |           |
    |ОВП=+200     |            |             |           |           |
    |             |            |             |           |           |
    |Анолит       |            |             |           |           |
    |физраствора  |     -6,2мВ |     Практически все тимоциты        |
    |рН=3,0       |            |              аглютинироны           |
    |ОВП=+500мВ   |            |             |           |           |
    L-------------+------------+-------------+-----------+------------

    Примечание: Тимоциты вносили в растворы из буфера выделения с  рН=7,4.
                 рНи ОВП в камере Горяева не контролировали.

         Реакция изолированных  митохондрий  на  различные  воздействия на
    уровне организма не вполне адекватно отражает истинное состояние энер-
    гетического обмена, т.к. в процессе разрушения клеток, выделения мито-
    хондрий и их инкубации в стандартных средах зачастую утрачивается вли-
    яние ключевых внутриклеточных факторов,  механизмов контроля и регуля-
    ции.  В связи с этим более достоверную информацию о изменении функцио-
    нального  состояния  митохондрий дают эксперименты на уровне суспензии
    клеток.  В последние годы в практике биоэнергетики широкое  применение
    нашли тимациты,  как наиболее доступный, легковыделяемый объект. В от-
    личие от суспензии изолированных митохондрий степень сопряженности ды-
    хания  с  фосфорилированием в тимоцитах оценивается следующим образом.
    Плазматическая мембрана не проницаема для АДФ,  но через  нее  беспре-
    пятственно  проходят такие соединения как 2,4-ДНФ (разобщитель окисли-
    тельного фосфорилирования,  протонофор),  олигмицин (ингибитор синтеза
    АТФ), ротенон, актимицин А и КС (ингибиторы дыхательной цепи). Началь-
    ная скорость потребления кислорода в тимоцитах соответствует 4 метабо-
    лическому состоянию (покоя) по Чансу (рис. 3.1.). В присутствии олиго-
    мицина у хорошо сопряженных митохондрий в тимоцитах наблюдается макси-
    мальное ингибирование дыхания,  которое соответствует именно той части
    дыхания, что сопряжена с синтезом АТФ. В цитозоле клетка в зависимости
    от физиологического состояния (гормоны, стресс, патология, температура
    и т.д.) меняется количество эндогенных разобщителей таких, как свобод-
    ные жирные кислоты или перекисные соединения и  т.д.  При  последующем
    добавлении  2,4-ДНФ  дыхания  тимоцитов максимально активируется,  при
    этом снимается ингибирующий эффект олигомицина, и в этих условиях оце-
    нивается состояние дыхательной цепи, наличие или отсутствие ингибирую-
    щий воздействий на ее уровне.
         В связи  с этим нами было исследовано влияние введения ЭВР с раз-
    личным значением на энергетический метаболизм митохондрий в  тимоцитах
    крыс.

                        Результаты и обсуждение

         В таблице  3.2  и  рис.  3.1.представлены результаты исследования
    влияния ЭВР на  энергетический  метаболизм  тимоцитов.Введение  крысам
    ЭВР-анолите  (+700  мВ)  вызывает стимуляцию дыхания в состояние V4 на
    53%, а добавление олигомицина вызывает торможение дыхания относительно
    контроля на 69%.  Динитрофенол в клетках этой группы животных стимули-
    рует дыхание на 42%  сильнее чем в контроле,  т.е.  результаты в целом
    указывают на то,  что эффективность фосфорилирования митохондрий в ти-
    моцитах примерно в 3 раза слабее,  чем в контроле. Можно полагать, что
    ЭВР-анолит (+700 мв) разобщает дыхание от фосфорилирования, однако ме-
    ханизм этого разобщения пока неясен.  Стимуляция дыхания тимоцитов  на
    54%  при  при введении крысам ЭВР-католит (-200 мв) не является следс-
    твием усилия разобщения окислительного фосфорилирования, т.к. олигоми-
    цин максимально тормозит скорость потребления кислорода на 73%  эффек-
    тивнее чем в контроле.  Это говорит о том, что в условиях этого экспе-
    римента энергообеспечение тимоцитов данной группы животных идет с наи-
    большей эффективностью.
         Данные из  таблицы  3.8  о  введении крысам ЭВР-католита (-400мв)
    свидетельствуют о том,  что дыхание тимоцитов в состоянии  V4  относи-
    тельно контроля стимулированно на 48% и в присутствии олигомицина ско-
    рость потребления кислорода увеличена на 53% против контроля,т.е. мож-
    но констатировать,  что эффективность фосфорилирования при такой высо-
    кой скорости дыхания несколько ниже,  чем  контрольных  клетках,  хотя
    этому, видимо, соответствует общая активация клеток.
         И в последней серии экспериментов при введении крысам ЭВР-католи-
    та (-600 мв) мы также наблюдаем значительную стимуляцию дыхания,  но с
    очень низким показателем энегрообеспечения,  о чем свидетельствует вы-
    сокая скорость дыхания в присутствии олигомицина, которая на 75% боль-
    ше, чем в контроле.
         Титрование лимфоцитов 2,4-ДНФ дает информацию  о  количестве  ин-
    тактных полноценных клеток,  т.е.  о количествах функционирующих дыха-
    тельных цепочках.  Во всех экспериментах количество внесенных в ячейку
    клеток  составляло  10*8 на мл.  Степень повреждения клеток в процессе
    выделения была минимальной, что свидетельствует о стабильности плазма-
    тической мембраны во всех группах экспериментов. Из таблице видно, что
    максимально стимулированная скорость потребления кислорода в  присутс-
    твии  2,4-ДНФ обнаружена в тимоцитах крыс,  которым вводили ЭВР-анолит
    (+700 мв), ЭВР-католит (-20мв) и среднее значение (-400 мв).
         Таким образом,  в условиях нашего эксперимента введение ЭВР-като-
    лита (-200 мв) является наиболее эффективным приемом, повышающим энер-
    гообеспечение тимоцитов,  максимально сопрягающим дыхание и фосфорили-
    рование и стабилизирующим мембраны на клеточном и  субклеточном  уров-
    нях.  Существенную  активацию  окислительного и энергетического обмена
    вызывает также введение ЭВР с Еп-400 мв.  В дальнейшем  представляется
    целесообразным  исследовать функциональное состояние изолированных ми-
    тохондрий в экспериментах. В часности их Са2+ емкость, активность фос-
    фолипидов А 2, проницаемость для одно- и двухвалентных катионов. Необ-
    ходимым этапом является также анализ состояния внутриклеточных  "депо"
    кальция, т.к. именно Са2+ реализует состояние активации клеток.

                                                  Таблица 3.8

            Влияние введения животным ЭВР с различным значением
                  Eh на дыхание и энергетический обмен
                         изолированных тимоцитов.

    ---------T------------------------------------------------------
    |        |  Скорость потребления кислорода, нмоль О2 за 1 мин. |
    |        |               на 10 8 клеток                        |
    |Вариант +------T------T---------------------------------------+
    | опыта  |      |      |       Концентрации ДНФ,мкМ            |
    |        | V4   |Vолиг +---------T---------T---------T---------+
    |        |      |      |  20     |  40     |  80     |   120   |
    +--------+------+------+---------+---------+---------+---------+
    |контроль| 13.0 | 2.6  |  18.0   |  30.0   |  32.0   |  28.0   |
    |        |      |      |         |         |         |         |
    |физ.р-р | 20.5 | 3.5  |  13.0   |  19.0   |  26.0   |  24.0   |
    |        |      |      |         |         |         |         |
    |Е +700  | 27.3 | 8.4  |  13.3   |  30.1   |  51.8   |  48.3   |
    |        |      |      |         |         |         |         |
    |Е -200  | 29.1 | 0.7  |  38.0   |  49.0   |  52.0   |  40.0   |
    |        |      |      |         |         |         |         |
    |Е -400  | 25.1 | 5.5  |  25.5   |  26.0   |  42.0   |  39.0   |
    |        |      |      |         |         |         |         |
    |Е -600  | 29.6 | 10.4 |  20.5   |  26.0   |  36.7   |  30.0   |
    L--------+------+------+---------+---------+---------+----------

Дом. | Главная | Отзывы